Alteraciones cromosómicas en trabajadores expuestos a benceno en una refinería de petróleo de Ecuador

En algunos estudios realizados se evidencia la relación existente entre exposición a derivados de hidrocarburos en una refinería de petróleo y alteraciones cromosómicas; en el estudio realizado en trabajadores expuestos a hidrocarburos se determina la relación existente entre exposición y alteración expresadas en aberraciones e inestabilidad cromosómica en una muestra representativa de trabajadores expuestos en una refinería de petróleo en Ecuador
Keywords: 
exposición a hidrocarburos, alteraciones cromosómicas
Main Author: 
Luís
Vásquez
Co-authors: 
Carlos
Ruiz-Frutos
Jose Antonio
Garrido

Instituto de Seguridad y Salud, Universidad San Francisco de Quito Avda. Diego de Robles. Quito Ecuador

2403170/  luisvasquezzamora@hotmail.com

Garrido, José Antonio

Departamento de Biología Ambiental y Salud Pública. Facultad de Ciencias Experimentales / Universidad de Huelva / Campus de El Carmen / 21071 Huelva, España/ jose.garrido@dbasp.uhu.es

Ruiz-Frutos, Carlos

Departamento de Biología Ambiental y Salud Pública. Facultad de Ciencias Experimentales / Universidad de Huelva / Campus de El Carmen / 21071 Huelva, España +34 959219875 /frutos@uhu.es

ABSTRACT

ABSTRACT

En algunos estudios realizados se evidencia la relación existente entre exposición a derivados de hidrocarburos en una refinería de petróleo y alteraciones cromosómicas; en el estudio realizado en trabajadores expuestos a hidrocarburos se determina la relación existente entre exposición y alteración expresadas en aberraciones e inestabilidad cromosómica en una muestra representativa de trabajadores expuestos en una refinería de petróleo en Ecuador

Palabras clave: Exposición a hidrocarburos, alteraciones cromosómicas

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

En el Ecuador, la producción petrolera ha mostrado un crecimiento vertiginoso a partir de 1975 e involucra cada vez a un mayor grupo de personas. El petróleo es fundamental para la economía ecuatoriana (1,2), sin embargo su impacto ambiental y efecto sobre la salud de los trabajadores, es motivo de interés y preocupación (3). Durante la manipulación y procesamiento del petróleo se producen varias sustancias, muchas de las cuales ya se han evidenciado como muta génica y/o carcinogénicas en varias especies animales, incluyendo al hombre. (4).

Estudios previos señalan que la identificación de aberraciones cromosómicas e inestabilidad cromosómica, constituyen valiosas pruebas predictivas de malignidad; existen normas y recomendaciones internacionales que sugieren que se deben realizar monitoreos cromosómicos de poblaciones expuestas a cancerígenos como son los producidos en la explotación petrolera (5).

Desde cuando Percivall Pott describió la ocurrencia de cáncer de escroto en numerosos pacientes, expuestos laboralmente a polvo de chimeneas durante su juventud, múltiples investigadores se han preocupado por establecer las relaciones de la exposición laboral y ambiental a sustancias potencialmente tóxicas especialmente relacionadas con la producción de tumores malignos y enfermedades crónico-degenerativas (6,7).

En cultivos de linfocitos de trabajadores, expuestos a petróleo destilado en parafina de aceite crudo, se encontró incremento de gaps y quiebras cromatídicas e intercambio de cromátides hermanas (ICH), generalmente atribuidas a la exposición al benceno y sus metabolitos(8,9,10,11).

El benceno es considerado cancerígeno 1A por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC), se ha demostrado que la exposición al benceno y cloruro de vinilo está relacionado con el aparecimiento de leucemia mieloide, angiosarcoma y colangiocarcinoma hepático, cáncer de SNC y tracto respiratorio (12,13) Los aceites minerales y del petróleo, antraceno, benzopireno, indeno pireno, acrilonitrilo fluoranteno, epicloridín, aminas aromáticas, N-Nitrosodi-n- butilamina, N-nitrosodietilamina, N-nitrodimetilamina, N-nitrosomorfolina, N- nitrosopiperidina, N-nitrosopirrolidina, inducen el aparecimiento de neoplasias de vejiga en humanos y animales (14)

También se ha señalado que existe la posibilidad de que la exposición albenceno esté relacionada con cáncer pulmonar, la carcinogenicidad del benceno en losórganos blancos depende de la capacidad de las enzimas en los órganos parametabolizarlo, el mecanismo de genotoxicidad de los multimetabolitos es otro aspecto único del benceno que lo distingue de otros químicos en los mecanismos de toxicidad y carcinogenicidad. (15).

Las aberraciones cromosómicas estructurales producidas por bencenosugieren que son dosis dependientes de las concentraciones de benceno en el aire (16)

Los solventes orgánicos como: hexano, tolueno, methyl, ethyl ketone (MEK) yformaldehído (FA) pueden causar alteraciones citogenéticas, mientras que el tolueno determina un aumento significativo en la frecuencia de aberraciones cromosómicas y de ICH lo que indica que hay una acentuada acción mutagénica en humanos y animales. (17)

El benceno y tolueno incrementan los niveles de unión con sitios específicoscon la cadena del ADN que codifica para p53 que puede ser la causa de daño del ADN celular y del incremento progresivo de las células a la malignidad por su efecto sobre la kinasa dependiente de ciclina (18). Por lo tanto, este estudio intenta comprender la relación existente entre la presencia de contaminantes como indicadores de exposición con cambios clastogénicos en trabajadores de la industria del petróleo.

BLEOMICINA (BLM): Es un antibiótico antitumoral soluble en agua derivado de los glicopéptidos, aislado del "streptomyces verticillus" (19), posee actividades: antimicrobiana, antiviral y antitumoral, actúa como un alquilante radiomimético (20), produciendo una inhibición de la síntesis y ruptura de la cadena del ADN en cultivos celulares in vivo e in Vitro (21), inhibición de la mitosis (22), no induce degradación significativa del ARN en células de mamíferos (23). La ruptura del ADN se da preferentemente en las regiones ricas en timidina, citosina, adenina, y guanina, teniendo más avidez por los sitios en donde se encuentra G-C y G-T (24),produciendo liberación de bases (70 % timina, 22 % citosina, 8% adenina) (25), radicales libres e hidrolasas (26), degradación del nucleosoma, ruptura de las uniones fosfodiéster (24, 27),destrucción de la desoxirribosa (28), inhibición de los precursores de ADN y de síntesis de proteínas (29).

La droga utilizada en nuestra investigación es el Blenoxane que está constituida por una mezcla de bleomicina A2 (60-65%), bleomicina B2 (30%) y dimetil bleomicina A2, glucosa, 3-O-carbomyl-D-manosa, 5-aminoácidos y una amina(Berry et al 1985) que produce muerte celular, daño cromosómico y retardo del ciclo celular (Fisher 1985) debido a que su acción es semejante a muchos de los efectos moleculares y citológicos de las radiaciones ionizantes (22, 30).

La BLM puede actuar directamente sobre el núcleo, alterando las membrana celular y nuclear, produciendo aberraciones cromosómicas en mitosis (22) y en interfase en las regiones extendidas de cromatina (31), produce hipertrofia de los organelos celulares (mitocondria, cuerpo de Golgi) e incrementa el volumen de las células multi nucleadas (20).

Está bien establecido que la BLM induce daño cromosómico (32,33), tipo dicéntricos, anillos (31,34), condensación prematura centromérica (35), fragmentos acéntricos e intercambio cromatídico (36), pulverización cromosómica (33,37), muerte celular (20); de los cromosomas, los más afectados son los brazos cortos y los cromosomas de los grupos A y D; mientras que el cromosoma 3 es el mas resistente (32). Los efectos genotóxicos de la BLM pueden ser modificados cuantitativamente por componentes teólicos, cafeína hipertemia y H2O2 (26).

Las quiebras son de hasta 1020 x 10 8 bases (Berry et al 1985), la generación de aberraciones cromatídicas demuestran que la acción de la BLM no es S-dependiente (38).

Se ha demostrado que muchos tipos de cáncer en el hombre están asociados con específicas o no específicas aberraciones cromosómicas (34)

EXPOSICIÓN

La exposición y sus criterios de evaluación son un aspecto fundamental en estudios de salud ambiental, por lo que es importante identificar las fuentes de exposición ambiental y qué contaminantes están asociados a ésta para luego proceder a su medición.

A lo largo de la existencia de la Refinería Estatal de Esmeraldas se han realizado algunos esfuerzos para identificarlos claramente y para controlar la contaminación. (39,40)

OBJETIVOS / MATERIAL Y MÉTODOS �

Se analizó un total de 44 personas para estudios citogenéticas.

Obtención de Muestras para Estudio Citogenética. La toma de muestras de sangre para la determinación de Aberraciones Cromosómicas, consistió en la extracción 5 ml de sangre venosa con sistema de extracción al vacío y tubo colector con heparina de litio. La muestra fue trasladada en cadena de frío para su procesamiento en un máximo de 8 horas subsiguientes a la extracción.

Preparación y Procedimiento del Cultivo (41). Cada medio de cultivo sepreparó en las siguientes concentraciones: 7.5 ml. de medio (RPMI 1640), 2ml.de suero bovino fetal (SBF), 0.1 ml de solución de aminoácidos no esenciales (10 mM), 0.1 ml. de l-L-Glutamina (200 mM), 0.15 ml de fitohemaglutinina (PHA), 0.1 ml de solución de antibiótico-antimicótico (concentración final en el medio: Penicilina=100 UI/ml, estreptomicina=100 ug/ml y anfotericina=0,25 ug/ml).

Cada muestra de sangre fue sembrada por duplicado usando frascos de cultivo de 50 cm3 (Leyton®), colocando en cada uno de ellos 1.5 ml de sangre total y 7.5 ml de medio de cultivo, en cámara de flujo laminar con seguridad tipo II por 72 hs., a uno de los frascos se le adicionó 2ug/ml de Bleomicina (Blenoxane - Bristol®) para el estudio de inestabilidad cromosómica.

Dos horas antes de procesarlos, se añadió a cada cultivo 0.16 ml de Colcemid(25ug/ml-SIGMA®) yse procedió a la cosecha de células. Para el análisis citogenético se usó un fotomicroscopio CarlZeiss axioscop, seleccionando metafases que presenten cromosomas separados sin superposición.

Se analizaron 200 metafases de cada individuo: 100 para aberraciones cromosómicas y 100 para inestabilidad cromosómica.. El análisis comprendió observación, diseño y fotografía de los cromosomas con lente objetivo de inmersión (100X) y con optobar de 2,5X, distinguiendo: grupos y brazos cromosómicos de acuerdo a un protocolo elaborado, siguiendo las normas establecidas por las conferencias de Chicago y París. Para el análisis de las aberraciones cromosómicas se excluyen las metafases con número menor a 44 cromosomas (42).

Los datos obtenidos de los análisis cromosómicos y de las encuestas fueronprocesados mediante la elaboración de una base de datos, con ayuda del paquete EpiINFO 6.04.

RESULTADOS

Se estudiaron un total de 44 trabajadores, en quienes se realizó estudio de fragilidad cromosómica. Las medias de aberraciones cromosómicas encontradas se presentan en la siguiente tabla

Tabla 1. Análisis de aberraciones cromosómicas 1640 Esmeraldas, 2007.

(RPMI 1640+ SBF +

(RPMI 1640+ SBF + PHA) PHA+BLEMOCINA

Aberraciones X ± S* Valor de X ± S* Valor de

referencia % referencia %

gct = gap cromatídico 11.5 ± 6.1 4 12.9 ± 7 9

gcs = gap cromosómico 3.8 ± 2.5 4 7.4 ± 4.2 9

bct = ruptura cromatídico 5.1 ± 2.7 3.83 11.7 ± 4.9 10

bcs = ruptura cromosómico 1.9 3.83 4.9 10

r = anillo 0.07 0 0.14 2

dic = dicéntrico 0.25 0 0.18 2

ace = acéntrico 5.8 3.83 13.9 ± 5.5 10

asosat = asociación satélite 18.8 ± 6.7 5 17.3 ± 7.2 7

pvz = pulverizaciones 0.07 2 1.1 0

opct = apertura cromatídica 2.2 1 2.6 7

inst = inestabilidad 1.8 0 4.4 0

pp = poliploidia 0.59 0 0.6 0

doble minute 0 0 0.1 0

rea= rearreglo 0.2 0 0.02 0

Hors= rupturas Múltiples 0.05 0 0.23 0

* No se presentan los desvíos estándar cuando este supera a la media.

Los porcentajes de sujetos que superaron el valor de referencia por tipo de aberración y medio empleado, se muestra en los siguientes gráficos.

(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina

(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina (S) = Cultivo estándar / (B)= Cultivo con Bleomicina

(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina

(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina

(S) = Cultivo estándar / (B) = Cultivo con Bleomicina

De los hallazgos presentados en las gráficas anteriores, se puede observar que la aberración en donde más se supera el límite aceptable es la asociación satelital (asosat), seguida de la presencia de gaps cromatídicos (gct), acéntricos (ace) e inestabilidad cromosómica (ines) presentes en cerca de la mitad de casos estudiados.

DISCUSIÓN

Según lo que se demuestra en la tabla I, se puede apreciar que los cromosomas metafásicos de linfocitos de sangre periférica de la población analizada, presenta un incremento de las siguientes aberraciones por sobre el punto de corte del laboratorio, tanto en medio de cultivo estándar (RPMI 1640), como en medio de cultivo a quien se le adicionó un alquilante radiomimético (bleomicina): gaps y quiebras cromatídicas, fragmentos acéntricos, inestabilidad cromosómica, poliploidias, rearreglos cromosómicos y altas regiones coloreadas, rea y asociación satelital. Estos resultados son similares a los encontrados por López R y cols, en un trabajo realizado el año pasado en pobladores cercanos a la refinería de Esmeraldas (43).

Resultados similares a los nuestros, en relación al aumento de gaps y no derupturas cromosómicas fueron encontrados por Anderson 1990 (44), al analizar cromosomas de linfocitos en sangre periférica de trabajadores expuestos al estireno; por lo que se ha sugerido que los gaps son indicadores de baja exposición a agentes genotóxicos y su análisis puede ser usado como un parámetro útil en test de genotoxicología en personas expuestas a dosis bajas de tóxicos como lo señala Brogger 1982(45). La visualización de gaps y quiebras es uno de los pocos métodos directos para medir las grandes alteraciones del ADN como lo señalan Carrano & Natarajan 1988, en un ya clásico trabajo de la citogenética (46). Otros estudios señalan que el incremento en la incidencia de brechas isocromatídicas (gaps) es frecuentemente observarlas después de tratamiento con agentes químicos. Sin embargo, la presencia de los gaps no puede ser considerada como una verdadera discontinuidad de la estructura cromosómica y en muchos de los casos son resultados de artefactos técnicos como lo señala Evans & O'Riordan 1975 (47). Se ha encontrado también que en trabajadores del caucho y del PVC expuestos crónicamente a niveles altos de contaminantes, los gaps se transforman en rupturas cromosómicas (48). También existen reportes que inclusive consideran que las rupturas cromatídicas no son indicadores reales del daño del material genético (47).

Sin embargo no debe olvidarse que, la presencia de aberraciones cromosómicas debido a la exposición a químicos y/o contaminantes, puede ser complicada debido a la presencia de agentes externos ambientales, tales como calor, impurezas, productos contaminantes, agentes ionizantes, etc. o por exposiciones previas, produciendo aberraciones cromosómicas persistentes en los linfocitos, debido a la larga vida media de los mismos como lo señalaron previamente Green & Hathway 1975 (49).

Se ha sugerido que la presencia de las aberraciones cromosómicos en los linfocitos se deben entre otros a los siguientes procesos: prolongada inducción de lesión, disminución del poder de reparación de la lesión, continua redistribución de linfocitos en el “pool” circulante y a que la remoción de los linfocitos dañados es un proceso lento (45), se ha demostrado que una vez eliminada la exposición, los daños podrían disminuir a niveles normales de 2 a 3.5 años después (44,50).

También en la tabla 1, se observa que cuantitativamente aumentaron significativamente todas las aberraciones, excepto la asociación satelital, demostrándose que la Bleomicina es un poderoso inductor de aberraciones cromosómicas y es útil para clarificar la inestabilidad cromosómica, quizá la disminución de las asociaciones satélites se debe a que las frágiles uniones por puentes de cromatina que se produce entre los cromosomas acrocéntricos se rompan. Nuestros hallazgos respecto a la inducción de aberraciones cromosómicas concuerdan con lo reportado previamente por otros investigadores (22, 28, 33). Las quiebras inducidas por la BLM son de hasta 1020 x10 8 bases, el aumento de aberraciones se presentan en valores que varían entre 10 al 86% en comparación con células no tratadas (22).

También es necesario analizar la posibilidad de otros factores de confusión que podrían estar produciendo los daños cromosómicos encontrados, tales como: consumo de cigarrillo, alcohol, medicinas, exposición a radiaciones ionizantes, ocupación, tiempo de trabajo, años de residencia en el sector etc.

CONCLUSIONES

  • 1. Se evidencia la presencia de alteraciones cromosómicas de  tipo cromátide, cromosómica y de número.
  • 2. La asociación satelital resulta un indicador interesante para monitorear a la población analizada.
  • 3. La Bleomicina es un  excelente  inductor  de  aberraciones  cromosómicas  por tanto es útil para los estudios de inestabilidad cromosómica.
  • 4. Se debe destacar  la importancia de este  tipo de estudios, pese a que los resultados no son definitivos ni concluyentes y que solamente pueden aceptarse para este tipo y diseño de estudio. Dentro de estas condiciones y en este ámbito se requerirían confirmaciones más prolijas y más amplias para poder convertirlas en demostraciones, por ahora imposibles de generalizarse. Sin embargo, dejan  entrever  que  es  muy  importante  evaluar simultáneamente el ambiente con la salud.

REFERENCIAS

  • 1. PetroEcuador, El Petróleo en Ecuador: Su historia y su importancia en la economía nacional. Ecuador. (2002).
  • 2. Vaca  Rodríguez,  Augusto,  Riesgos  del  Trabajo  en  la  Industria  Petrolera. PetroEcuador. Ecuador (1995).
  • 3. PetroEcuador, Atlas Petrolero Ecuatoriano. Ecuador. (2004).
  • 4. IARC. Benzene. IARC. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans, suppl 7, IARC  Lyon 1987: 120¬122.
  • 5. Vainio HK, Sorsa M, Rantanen J, Hemminki K & Aitio A. Biological monitoring in  the identification of the  cancer  risk  of  individuals  exposed  to  chemical carcinogens. Scand. J. Work Eviron. Health. 7:241251 (1981).
  • 6. Basler   A.   Scientific   Justification   of   Testing   Chromosome   Mutation   and Regulatory. Requeriments for the Assessment Mutagenicity. Ed Obe & Baster SpringerVerlag  Berlin.  (1987).
  • 7. Rossner P, Boffeta P, Ceppi M, Bonassi S, Smerhovsky Z, Landa K et al., Chromosomal  aberrations  in  lymphocites  of  healthy  subjects  and  risk  of cancer. Environmental Health Perspectives 113(5): 517520. (2005).
  • 8. Dean BJ. Recent findings on the genetic toxicology of benzene, toluene, xilene and phenols. Mutat Res 154. : 153181.(1985).
  • 9. Yager JW, Eastmond DA, Robertson ML, Paradisin WM,  Smith  MT. Characterization of micronuclei induced in human lymphocytes by benzened metabolites. Cancer Res 50: 393399. (1990).
  • 10. Smith,  MT,  Rhotman   N.  Bikomarkers  in   the  molecular  epidemiology   of benzenene  exponed  workers.  J.  Toxicol  Environ  Health  Part  A  61,  447 456.(2000).
  • 11. Zhang L., Eastmond DA, Smith MT. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit Rev Toxicol 32: 142.(2002).
  • 12. Forni AM, Cappellini A, Pacifico E & Vigliani EC. Chromosome changes and their  evolution  in  subjects  with  past  exposure  to  benzene.  Arch  Env  health. 23:385391   (1971).
  • 13. American Conference of Governmental Industrial Higienists. Documen of TLV for gasolina. In Chemical Substance TLVs and BEIs 2000, Cincinnati, Ohio: ACGIH, (2000).
  • 14. Fustinoni S, Buratti M, Campo L, Colombi A, Consonni D, Pesatori a: et al. Urinary,      t,tmuconic      acid,    S¬phenylmercapturic         acid    and    benzene     as biomarkers  of  low  benzene  exposure.  ChemicoBiological  Interactions  153 154:  253256.  (2005).
  • 15. Dees        C; Askari M; Henley D Carcinogenic potential of benzene and toluene when evaluated using cyclin¬dependent kinase activation an p53 AND biding. Environ Health Perspect; 104 Suppl 6: 128992 1996.
  • 16. Collegium Ramazzini. 2004. Call for a reduction of exposure to benzene to the lowest possible level. Eighth Collegium Ramazzini Statement.
  • 17. Violnte   F, Sanguinetti G Barbieri A, Accorsi, A, Mattioli S, Cessari R et al. Lack of correlation between environmental or biological indicators of benzene exposure at parts per billon.
  • 18. Tompa Anna, Mátyás G. Jakab, Jenó Major. Risk management among benzeneexposed oil refinery workers. Int J Hyg Environ Health 208 : 509 516.(2005).
  • 19. Takeshita             M,  Horwitz  SB  &  Grollman  AP.  Bleomycin,  an  inhibitor  of vaccinic virus replication . Virology. 60:455465 (1974).
  • 20. Vig BK & Lewis R.     Genetic  toxicology  of  Bleomycin.  Mutat  Res.  55:125 145  (1978).
  • 21. Umezawa K, Mutsuko S Taijiro M & Sugimura T. Inhibition of chemically induced sisterchromatid exchanges by clastatinas. Chem Biol Interact 24:107110 (1979).
  • 22. Berry D, et al. DNA damage and growth Inhibition in cultured human cells by bleomycin congeners Biochemistry. 32073214 (1985).
  • 23. Kuo MT. Preferential damage of active chromatin by bleomycin. Cancer Res. 41:24392443 (1981).
  • 24. Haidle CW, Weiss KK & Kuo MT. Release of free bases from DNA after reactions with bleomycin Mol.
  • 25. Povirk L F. Bleomycin in: Neidel S & Waring MJ (Eds). Molecular Aspects of Anticancer drug action. (Neidle & Waring De) London: 157181 (1983).
  • 26. Larramendy ML, LópezLarraza D, VidalRioja L & Bianchi NO. Effect of the metal chelating agent o¬phenanthroline on the DNA and chromosome Damage Induced by Bleomycin in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res. 49:65836586 (1989).
  • 27. Kuo MT, Haidle CW & Inners   LD.  Characterization  of  bleomycin  resist  DNA. Biophys. J. 13:12961306 (1973).
  • 28. Fisher M, Kuroda R & Sakai TT. Interaction of bleomycn A2, with Deoxyribonucleic acid: unbinding and inhibition of bleomycin induced DNA breakage by cationic thimidazole amides.  Related  to  bleomycin A2.Biochemistry.  24:31993207  (1985).
  • 29. Umezawa H, Ishizuka M & Takenchi T. Studies on bleomycin. Cancer (Phila). 20:891895 (1967).
  • 30. 30. López R.    Efectos Mutagénicos de la Fototerapia en Linfocitos Humanos de Neonatos Hiperbilirrubinémicos. UCE.179 (1990).
  • 31. Kuo MT & Hsu TC. Biochemical and cytological studies of bleomycin actions on chromatin and chromosomes. Chromosoma (Berl). 68:289240 (1978).
  • 32. Ohama K & T Kadotani. Cytological effects of bleomycin on cultured human leukocytes. Jpn. J. Hum. Genet. 14:293297 (1970).
  • 33. López R, Félix C. Ruales J. y cosl. Inestabilidad cromosómica en neurofibromatosis. Rev. FCM. 1723 (1991).
  • 34. López      R.Harari  R.  Plaguicidas  y  Cromosomas.  EN:  Seguridad  Salud  y Ambiente en la Floricultura. IFA¬PROMSA, 88114 (2004).
  • 35. Sognier M, Hittelman NN & Pollard M. ″ The relation ship between DNA and chromosome damage after bleomycin tratament:  dosis  response measuraments″. Mutation Res. 93:149159 (1982).
  • 36. Tamura  H,  Sugiyama  Y  &  Sugahara  T.  Bleomycin  induced  chromosome aberrations  in  cultured  human  lymphocytes  at  various  cell  phases.  Acta Obstet. Gynecol. Jap. 22:120 (1975).
  • 37. Savage JR.           Clasification     and    relation     hips    of   induced     chromosomal structure changes. Journal of Med Genet. 21:103122 (1975).
  • 38. Dresp J, Schmid ES & Bauchinger M. The cytogenetic effect of bleomycin on peripheral lymphocytes in vivo and in vitro. Mutation Re. 56:341343 (1978).
  • 39. IFASueciaPetroindustrial,  Convenio  de  Cooperación  Internacional  para  el Proyecto  de  Mejoramiento  del  Medio  Ambiente  Laboral  y  la  Producción  en Refinería Estatal de Esmeraldas. Informe Final. (1993).
  • 40. FASueciaPetroindustrialCOIFA Ecuador, Development of measurements for investigation of exposure levels of some organic solvents at the refinery in Esmeraldas. Proyecto para el desarrollo de las actividades del mantenimiento, condiciones de trabajo y reducción del impacto ambiental en la refinería de Petroindustrial en Esmeraldas, Ecuador. (a) (19921995).
  • 41. Moorhead            PS, et al. Chromosome preparation of leucocytes cultures from human peripheral blood. Exp Cell Res. 20:613616 (1960).
  • 42. ISCN       An    international       system     for    human      cytogenetic     nomenclatura. Cytogenetic Cell Genetics. 6669 (1985).
  • 43. López R, Torres C, Rodríguez A y cols. Exposición a benceno, tolueno y xileno y efectos sobre la salud en poblaciones aledañas a una refinería de petróleo en Ecuador. Memorias de la Conferencia Salud Ocupacional y ambiental: Emergencia en los Países en Desarrollo. 226242 (2006).
  • 44. Anderson BE, Zeiger E, Shelby MD, Resnick Ma, Gulati DK, Yvett JL, Loveday KS. Chromosome Aberration and Sister.
  • 45. Brogger   A.   The   chromatid   gapa   useful   parameter   in   genotoxicology? Cytogenet Cell Genet. 33:1419 (1982).
  • 46. Carrano AV &  Natarajan AT. Considerations for  population monitoring using cytogenetic techniques. International commission for protection against environmental mutagens and carcinogens. Mutation Res 204:379406 (1988).
  • 47. Evans HJ         & O'Riordan ML. Human peripheral blood lymphocytes for the analysis of chromosome aberrations in mutagen test. Mutat Res. 31:135148 (1975).
  • 48. Moore      RC.   Effects   of   1BDarabinofuranosylcytosine   on   chromosomes, depending  upon  the  cell  cycle  stage  at  the  time  of  exposure.  .Mutat  Res. 83:361374 (1981). 50. Hansteen K, Hallestad L, ThissEvensen E & Heldaes S. Effects of vinyl chloride.
  • 49. Green T & Hathway DE. The biological fate in rats of vinyl chloride in relation to its carcinogenicity. ChemBiol Interact. 11:545562 (1975).